一、简介

    His标签蛋白（竞争法）快速检测试剂盒是基于胶体金侧向层析技术的蛋白半定量检测试剂。主要结构由样品垫、金标垫、层析膜、吸水纸、背板等组成。在层析膜上固定有金标抗体的二抗（质控线）和带有His-tag的蛋白（检测线）；在金标垫上固定有胶体金标记的抗His-Tag的单克隆抗体。当待测样品滴加到样品垫时，通过毛细作用，液体向金标垫移动。当不含有His-Tag蛋白的待测样品通过金标垫时，His-Tag金标抗体随着层流移动到检测线位置，与固定在检测线上的带有His-tag的蛋白发生特异性结合，并在检测线上形成酒红色条带；当含有His-Tag蛋白的待测样品通过金标垫时，His-Tag金标抗体与待测样本中的His-Tag蛋白发生特异性的结合，样本中含有的His-Tag蛋白越多，与之结合的金标His-Tag抗体越多，剩余的游离His-Tag金标抗体越少，随着层流移动到检测线位置，游离的His-Tag金标抗体与固定在检测线上的带有His-tag的蛋白发生特异性结合，并在检测线上形成淡淡的酒红色条带或者不显带。当复合物移动到质控线时，His-Tag金标抗体被包被在质控线的金标抗体二抗所捕获，并在质控线上形成酒红色条带。通过判读层析膜上检测线和质控线是否显色及显色的强弱，判断样品中是否存在His-Tag蛋白。本试剂检测下限为10ug/mL，即当待测样品中His-Tag蛋白的浓度达到10ug/ml及以上浓度时，检测线的强度会被有效的削弱，显示出淡淡的酒红色条带或不显色。当检测样品中His-Tag蛋白浓度在10ug/mL至100ug/mL时，检测线颜色的深浅与样品中His-Tag蛋白的浓度呈负相关。当样本中的His-Tag蛋白浓度达到100ug/ml以上时，检测线发生消线即无肉眼可见条带出现。

二、用途

原核表达系统、真核表达系统获得的His-Tag蛋白产物，均可以使用本检测试剂进行快速检测。

三、组成

1）检测卡；2）稀释液；3）说明书

四、使用方法

1.将本试剂包装打开，将检测卡平放在生物安全柜台面上；
2.待测样本的预稀释：
若待测标签蛋白浓度已知，则利用试剂配套的稀释液直接稀释样本至30ug/ml；
若待测标签蛋白浓度未知，则利用试剂配套的稀释液对来源于细菌裂解液的待测样本进行4倍稀释，涡旋震荡混匀；对于来源于哺乳细胞裂解液的待测样本无需进行预稀释；
3.用微量移液器吸取20μl待检标本，滴加到样品孔中；
4.向样品孔中滴加50μL样品稀释液（滴瓶垂直滴加2滴），10-15分钟后即可判读结果。
注：建议每次检测都设置一个阴性对照检测卡（阴性对照卡加入的样本应同待测样本有相同的基质组成，并确定不含His-Tag蛋白），通过与阴性对照检测卡检测线显色强弱的比对，可以更加直观的得出实验结论。

五、常见洗涤剂与盐的兼容性上限如下表：
 

名称	浓度上限
NaCl	0.5M
Urea	0.4M
TritonX-100	1%
Tween-20	1%
SDS	0.2%
NP-40	1%
EDTA	5mM
甘油	10%
KCl	0.5M
CHAPS	1%
RIPA	100%

六、结果判断

1.在检测窗中，质控线和检测线均显色，且检测线显色强度与阴性对照一致即为阴性；
2.质控线显色，检测线不显色或者检测线显色强度明显弱于阴性对照，检测结果为阳性；
3.质控线不显色，无论检测线是否显色，均表明试剂失效，检测无效。（如图）



                             图 不同浓度样品检测卡显色样式

七、问题及解决
 

问题	可能原因	解决方案
质控线显色浅	样品中有干扰物质	用稀释液稀释10倍后重复试验
检测失败	试剂失效	检查保质期及保存环境条件