抗体的标记有哪些​‍

抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶），荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。
 
　　一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记
 
　　抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，现将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。
 
　　SOP抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）
 
　　标记以2mg抗体为例
 
　　1.抗体/蛋白的处理
 
　　1）待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3,0.035M NaHCO3,pH9.6)中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。
 
　　2.HRP酶的氧化
 
　　1）称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100μL ddH2O中。
 
　　2）称取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。
 
　　注意：此后的操作均在避光条件下进行。
 
　　３）吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。
 
　　３.抗体的标记
 
　　１）将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２小时。
 
　　２）称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置2hr（不能再透析），每30min摇动一次。
 
　　3）PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。
 
　　抗体/蛋白的HRP标记（戊二醛法）
 
　　参照多肽与载体偶联相关SOP Frdbio GA(Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联
 
　　二、抗体/蛋白的FITC标记
 
　　SOP FITC标记抗体/蛋白
 
　　1）将待标记的抗体/蛋白（浓度≧1mg/ml）对标记反应液(90mM NaHCO3，10mM Na2CO3，126mMNaCl,pH9.0)透析三次(4℃)。
 
　　2）将FITC(Frdbio)溶于DMSO中，浓度为20mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
 
　　3）（抗体/蛋白质：FITC）=1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8hr。
 
　　4）加入5M的NH4Cl至终浓度50mM，4℃终止反应2hr。
 
　　5）将标记产物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
 
　　6）交联物的鉴定
 
　　蛋白浓度(mg/ml)=[A280–0.31×A495]/1.4
 
　　抗体/蛋白质：FITC比例=3.1×A495//【A280–0.31×A495]】，该值应介于2.5～6.5之间。
 
　　7）FITC标记的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1%NaN3、1%BSA，30%甘油，短期保存于4℃避光，长期应该-20℃避光保存。
 
　　三、抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记
 
　　一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
 
　　蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
 
　　1、抗体/蛋白的前处理：
 
　　1）选择适当截留的超滤柱中加入400μl标记反应溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg抗体，混匀。
 
　　2）4℃，6,000rpm，离心2min,弃滤液；于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液，混匀。4℃，6,000rpm，离心2min,
 
　　3）重复步骤2 6到7次。
 
　　4）混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，1000×g，2min，收集液体。
 
　　5）取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃，6,000rpm，2min。收集液体。
 
　　6）步骤4与步骤5的收集的滤液合并，用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml，4℃放置备用。
 
　　2、生物素的标记：
 
　　7）将生物素溶解在其合适的溶剂中（请参照所选生物素的说明书，不同的生物素其溶剂不同），浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h。
 
　　8）葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。
 
　　9）将抗体保存于合适的抗体保存液
 
　　进行抗体标记的时候，需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解，否则很难标记出高品质的抗体；标记量低，导致信号值低；标记量太高，不但容易造成背景，并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗，反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多，不同类型的标记物其性质完全不一样，光是标记物都很难选择和把握，建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记，或者直接委托专业化公司标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品，同时可以提供抗体/蛋白标记服务。