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博奥龙BioShuttle 高效蛋白转染试剂—4h查看RNP基因编辑效率

时间 9/10/2024 10:43:02 PM

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BioShuttle 高效蛋白转染试剂
货号：KX0110052 
含量：1 ml (10mg/ml)
运输保存：冰袋运输，-20℃长期保存，稳定保存期 12 个月。

产品描述 
BioShuttle高效蛋白转染试剂是一种新型的阳离子脂质体转染试剂，用于将功能性蛋白高效地输送到真核细胞内，可高效转染RNP(sgRNA和Cas9蛋白复合物)。该转染试剂能够与蛋白形成带正电荷的非共价复合物，细胞膜表面带负电荷，能够将该复合体吸附，被吸附后的复合体能够通过膜融合作用或者细胞内吞的方式形成包涵体进入细胞，并释放到细胞质中进行解离。整个输送过程低毒，并可有效地传递功能性蛋白。

用途：
（1）胞内蛋白质递送研究；
（2）递送基因编辑CRISPR-Cas9蛋白质复合物

产品特点：
氮/磷比值低至1，细胞毒性小
材料稳定，数据重复性好
基因编辑效率高，媲美专业进口试剂
快速可靠，4h观察敲除效果


RNP转染方法：(以24孔板单孔用量为例)
1.细胞准备：在24孔板中加入1ⅹ105细胞/孔，孵育过夜。
                                                                                                                                                                           附表 转染前一天常见细胞接种量
培养器皿 表面积(cm2) 细胞接种量 铺板培养基用量(ml)
96孔板 0.4 1×104-3×104 0.2
24孔板 2 1×105-3×105 1
12孔板 4 2×105-4×105 2
6孔板 9 3×105-5×105 3
35mm培养皿 9 3×105-5×105 3
60mm培养皿 21 5×105-10×105 6
100mm培养皿 55 1×106-3×106 15
25cm2培养瓶 25 5×105-10×105 7
75cm2培养瓶 75 1×106-3×106 20
 
2.Bioshuttle转染试剂工作液准备：
计算所需用量，用HEPES缓冲液（25mM，pH7.4）将转染试剂母液稀释至1mg/ml。
备注：为确保重复性良好，稀释后的工作液不建议重复使用
 
3.CRISPR-Cas9/ sgRNA复合物准备：
计算所需用量，取1ug/孔CRISPR-Cas9蛋白与0.5ug/孔sgRNA，用在HEPES缓冲液稀释至20ul/孔，37℃孵育10分钟，形成CRISPR-Cas9/ sgRNA复合物(Cas9 RNP)。
 
4.Cas9 RNP -转染试剂复合物准备：
计算所需用量，取2ug/孔Bioshuttle转染试剂，HEPES缓冲液稀释至30ul/孔，与CRISPR-Cas9/ sgRNA复合物室温充分混合孵育1min，然后加入450µl无血清培养基（DMEM）稀释复合物，最终得到500ul/孔Cas9 RNP -转染试剂复合物。
 
5.弃掉细胞培养基，用PBS缓冲液洗涤每孔，弃掉PBS，然后每孔细胞中加入步骤4制备的500µl用无血清培养基稀释的Cas9 RNP -转染试剂复合物，37℃孵育4hr，可以检测到细胞的摄入水平。

注意事项：
  1. 为了最佳转染效率，推荐实验当天细胞应达到70-80%的密度。
  2. BioShuttle 高效蛋白转染试剂需在无血清、无双抗条件下进行转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板后，在加入复合物前需洗涤并移去生长培养基。也可根据细胞种类于转染6h后加入含血清培养基，继续培养观察。
  3. 推荐每孔Cas9 protein, sgRNA, 蛋白转染试剂，质量比，分别是2, 1, and 4 μg/mL，也可根据实验情况在此基础上进行质量比调整优化

       

图1：BioShuttle 高效蛋白转染试剂基因编辑效率优于同类型产品

        
 
图2： BioShuttle 高效蛋白转染试剂转染4h（左）、24h（右）后，在K562悬浮细胞中成功转染Cas9 RNP
客户反馈，在K562悬浮细胞中进行RNP转染，每孔Cas9 protein, sgRNA, 蛋白转染试剂，质量比分别是2, 1, and 4 μg/mL。转染4h（左）、24h（右）后，采用T7核酸内切酶方法评估基因编辑效率。sgRNA: 4h（左）即可成功观察到基因下调效果；Biodragon1&2：只加转染试剂，无RNP阴性对照组；NC：无效果的阴性对照sgRNA序列，每组做2个重复。

          
 
图3： BioShuttle 高效蛋白转染试剂转染4h（左）、6h（右）后，在HepG2贴壁细胞中成功转染Cas9 RNP
客户反馈，在HepG2贴壁细胞中进行RNP转染，每孔Cas9 protein, sgRNA, 蛋白转染试剂，质量比分别是2, 1, and 4 μg/mL。转染4h（左）、6h（右）后，采用T7核酸内切酶方法评估，成功观察到sg2基因编辑效果。sgRNA+Cas9: 4h（左）即可成功观察到基因下调效果；Cas9：不含sgRNA阴性对照组；NC：无效果的阴性对照sgRNA序列，每组做2个重复。
 
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