1.产品介绍
       红色荧光蛋白（Red Fluorecent Protein，RFP）是从海葵中分离得到的一种分子标记，常用于研究蛋白质的定位、报告基因表达和蛋白-蛋白质相互作用。Anti-RFP Affinity Beads  4FF是一种偶联了抗RFP抗体的琼脂糖填料，可以用于天然RFP、RFP突变体及其融合蛋白的免疫沉淀、免疫共沉淀、亲和层析等实验。本产品具有以下特点：1）使用的抗体和RFP之间具有极高的亲和力, 可以高效捕获裂解上清中的RFP标签蛋白；2）免疫沉淀后，SDS-PAGE检测， 背景更干净，更有利于鉴定蛋白相互作用。3）琼脂糖基材具有非特异性吸附低，兼容性好的特点，每毫升载量大于1 mg(最高可达到5 mg/ml RFP结合载量)，可以用于RFP融合蛋白的大量纯化。

                                                                                                                                              表1. Anti-RFP Affinity Beads 4FF产品性能

性能	指标
基质	高度交联的4%琼脂糖微球
配体	Anti-RFP Antibody
载量	＞1mg RFP标签蛋白/ml介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.3 MPa, 3 bar
试剂耐受	Stable up to 80℃,1 mM DTT,3 M Guanidinium·HCl,8 M Urea,2 M NaCI，2% Nonidet P40 Substitute,1% SDS,1% Triton X-100
储存缓冲液	1× PBS（含防腐剂）
储存温度	2-8℃

2. 试剂准备
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
Ø平衡/洗杂 Buffer: 50mM Tris，0.15M NaCl, pH 7.4
Ø酸性洗脱Buffer: 0.1 M glycine HCI, pH3.0
Ø中和液：1M Tris-HCl, pH8.0 
2.2 样品准备
       上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗杂缓冲液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3 样品纯化
3.1柱层析
1.将Anti-RFP Affinity Beads 4FF 装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
2.将样品加到平衡好的Anti-RFP Affinity Beads 4FF中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3.用10-20倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4.酸性洗脱：使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量15-25μl中和液/ml洗脱液，分管收集。
注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-RFP Affinity Beads 4FF 在洗脱液中不要超过20 min。
5.使用3倍柱体积的洗脱液清洗，然后用平衡液平衡至中性。
6.使用3倍柱体积的0.02%叠氮化钠，1×PBS平衡，2-8℃保存。
3.2静态吸附
1.填料准备：取适量的Anti-RFP Affinity Beads 4FF加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。
2.加入样品溶液，4°C或室温震荡孵育至少30 min（不能磁力搅拌），确保填料与样品溶液充分混合。
3.孵育完毕后，将填料混合液离心（5000×g离心1 min）或过滤收集填料。
4.将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。
5.用酸性洗脱液洗脱。
6.填料再生和保存参考3.1中5.和6.。
3.3免疫沉淀操作流程
1.填料准备：取40μl的Anti-RFP Affinity Beads 4FF（柱体积20μl）混合液加入到1.5ml离心管中，5000×g离心1min,吸弃上清。
2.填料加入0.5ml平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），5000×g离心1min,吸弃上清。重复一次。
3.加入200-1000μl样品到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1小时（对于易降解的蛋白，建议使用蛋白酶抑制剂，并在2-8℃层析柜中操作，冷库亦可）。5000×g离心1min,吸弃上清，小心 不要吸走填料。
4.洗杂：加入0.5ml的洗杂液，悬浮填料，轻轻混匀，5000×g离心1min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。
5.样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。
A：酸性洗脱
加入100μl的洗脱液，悬浮填料，室温孵育5min。 5000×g离心1min。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置4°C,长时间放置-20°C保存。
B：变性洗脱
实验室常规蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）中含有β-巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使介质配体变性，洗脱后的Anti-RFP Affinity Beads 4FF没办法重复使用。
每管中加入20μl 2× Loading Buffer, 95°C加热5min。 5000×g离心1min,吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

4. 问题及解决方案
 

问题	原因分析	推荐解决方案
洗脱组分中没有目的蛋白	种属不同	并不是每一种RFP蛋白 都可以结合Ant-RFP Afnity Beads,本产品确定结合TagRFP、turbo-RFP、 DsRed、 mRFP 、mChery 、mOrange 、 mPlum 、 mRuby 、 mKate2、 mRFPruby。
	样品中无标签融合蛋白	纯化前Westem检测是否有RFP标签融合蛋白。
	空间构象改变	Anti-RFP Afinity Beads对于RFP的结合,强烈依赖于RFP的空间构象，影响RFP构象的缓冲条件会影响Beads和RFP之间的结合。
副孔样品差异较大	细胞转染和样品制备差异	通常样品制备以后，需要进行蛋白浓度定量，各正副孔上样量需要一致。
	填料损失	填料在洗涤过程中有损失，琼脂糖填料离心后，每次移液需要注意不要吸走填料。最后一次洗涤以后，如果有液体残留，不同样品之间需要留有相同体积的残液。降低操作误差。
背景高	洗涤不充分，洗杂液残留	填料需要轻轻吹打分散开。可以考虑用SDS-PAGE的上样针，插入Beads中，尽量移走残液。最后-次洗杂更换新离心管。
	核酸影响	样品裂解时候，如果核酸过多,可能造成大量非特异性吸附，此时推荐使用本公司的超级核酸酶促进样品处理。同时也要注意，高速离心以后，转移样品不要将沉淀的细胞碎片转移。
结合效率低	孵育时间过短	在高浓度的RFP蛋白溶液中(1mg/ml) ,至少需要30分钟，填料才可以达到饱和。样品浓度低时建议延长时间至1 h以上或4°C过夜。
	填料粒径大，空间位阻影响结合	选择粒径更小的磁珠Anti-RFP Affinity Beads 4FF (1 μm),磁珠和RFP的结合速度可以大大提高，洗涤的时间也可以缩短。