MYC标签亲和层析介质 Anti-c-Myc Affinity Beads

货号: BDTL0071-5

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产品基本信息

  • 产品货号 BDTL0071-5
  • 别名 MYC标签亲和层析介质 Anti-MyC Affinity Beads
  • 产品名称 MYC标签亲和层析介质 Anti-c-Myc Affinity Beads
  • 类别 纯化试剂
  • 粒径 45-165
  • 用途 MyC抗体标签亲和填料

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产品详情

1.产品介绍 
Anti-c-Myc Affinity Beads 可以检测原核、真核表达的 c-Myc 标签融合蛋白。c-Myc 多肽是由人类染色体 8q24 上的c-Myc 基因编码,对应于人类 P62 的 410-419(EQKLISEEDL)氨基酸。Anti-c-Myc Affinity Beads 可以识别 C 端,N 端或内部 c-Myc 标签蛋白融合蛋白,可应用在 Western-blot 杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。
表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能
项目 性能
基质 4%琼脂糖微球
配体  Anti-c-Myc 人单克隆抗体
结合能力 ≈1 mg c-Myc 标签蛋白/ml 介质
粒径 (μm) 45-165
最大流速 0.1 MPa, 1 bar
储存缓冲液 1× PBS(含防腐剂)
储存温度 2-8℃
2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
  • 平衡/洗杂 Buffer: 50mM Tris,0.15M NaCl, pH 7.4
  • 酸性洗脱Buffer: 0.1 M glycine HCI, pH3.0
  • 竞争性洗脱Buffer: 50 mM Tris,0.15 M NaCl,100-500 μg c-Myc 多肽/ml,pH 7.4
  • 中和液:1M Tris-HCl, pH8.0
2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3 样品纯化
3.1柱层析
  1. 将Anti-c-Myc Affinity Beads 装入合适的层析柱,层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
  2. 将样品加到平衡好的Anti-c-Myc Affinity Beads中,收集流出液,可以反复上样增加结合效率。
  3. 用10-20倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
  4. 酸性洗脱:使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱,收集管中预先加好中和液,加入量10-20μl中和/ml洗脱液,分管收集。
注:酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡,Anti-c-Myc Affinity Beads 在洗脱液中不要超过20 min。
竞争性洗脱:使用 5 倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。
  1. 使用3倍柱体积的洗脱液清洗,然后用平衡液平衡至中性。
  2. 然后保存在PBS溶液(含防腐剂)中2-8℃保存。
3.2静态吸附
  1. 填料准备:取适量的Anti-c-Myc Affinity Beads加入层析柱中,流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。
  2. 加入样品溶液,4°C或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌),确保填料与样品溶液充分混合。
  3. 孵育完毕后,将填料混合液离心(5000×g离心1 min)或过滤收集填料。
  4. 将填料装入层析柱中,用平衡液清洗直至紫外稳定。
  5. 用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱参考3.14。
  6. 填料再生和保存参考3.1中5.6.。
3.3免疫沉淀操作流程
  1. 填料准备:取40μlAnti-c-Myc Affinity Beads(柱体积20μl)混合液加入到1.5ml离心管中,5000×g离心1min,吸弃上清。
  2. 填料加入0.5ml平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用),5000×g离心1min,吸弃上清。重复一次。
  3. 加入200-1000μl样品裂解液或细胞提取物到处理好的填料中,混合均匀,在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管,促使样品和填料充分接触并吸附,室温至少1小时。5000×g离心1min,吸弃上清,小心不要吸走填料。
  4. 洗杂:加入0.5ml的洗杂液,悬浮填料,轻轻混匀,5000×g离心1min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。
  5. 样品洗脱:可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。
A:酸性洗脱
加入100μl的酸性洗脱液,悬浮填料,室温孵育5min 5000×g离心1min。小心取出上清,不要吸到填料,用中和液中和。洗脱样品放置4°C,长时间放置-20°C保存。
B:竞争性洗脱
加入100μl竞争性洗脱液洗脱,室温孵育30min 5000×g离心1min。小心取出上清,不要吸到填料。洗脱样品放置4°C,长时间放置-20°C保存。
C:变性洗脱
实验室常规蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)中含有β-基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-c-Myc抗体变性,洗脱后的Anti-c-Myc Affinity Beads没办法重复使用。
每管中加入20μl 2× Loading Buffer, 95°C加热5min 5000×g离心1min,吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

4. 问题及解决方案
问题 原因分析 推荐解决方案
流穿中有目的蛋白 填料过载 减少上样体积或增加填料体积。
结合时间太短 延长样品和填料的结合时间。可过夜孵育。
标签未暴露 可以加入低浓度的变性剂,上样前透析。
溶液中试剂不兼容 样品上样前进行透析。
洗脱组分中没有目的蛋白 目的蛋白不稳定 使用新配制的样品。
低温操作。
细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂。
样品中无标签融合蛋白 纯化前Western检测是否有c-Myc标签蛋白
目的蛋白表达量太低 优化蛋白表达量。
增加上样量,减少NaCI浓度。
背景太高 非特异性吸附 最后一次洗杂后,填料转到新的管子里再洗脱或IP。
洗杂不充分 增加洗杂次数,每次清洗孵育5-10 min。
增加洗杂液中盐离子浓度。

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