产品基本信息

• 产品货号 BDTL0001
• 产品名称 蛋白A层析介质 rProtein A Beads
• 类别 蛋白表达
• 性能 > 40mg human IgG
• 粒径 45–165

图片

产品详情

1.    产品介绍
本品是用于分离和纯化单克隆抗体的通用性亲和层析介质，主要性能见下表。蛋白A 是 一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过 Fc 片段结合哺乳动物 IgG ，但是不与 狗 lgG 结合，不结合人 lgM、lgD 和 IgA 。蛋白A 与蛋白G 与不同来源及亚类的免疫球蛋白 结合能力不一样（见附表） 。天然蛋白 A 有五个 IgG 结合区域和一些未知功能的区域，重 组蛋白A 去除了与白蛋白及细胞表面结合位点，只含有五个 IgG 结合区域，减少了非特异 性吸附。
蛋白A 层析介质性能表
 

指标	性能
基质	4%琼脂糖微球
配体	重组蛋白 A
载量	>40mg Rabbit lgG/ml 介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.1 MPa, 1 bar
pH  稳定范围	3-10
储存缓冲液	20%乙醇 1 ×PBS
储存温度	2-8℃

2.    纯化流程
2.1 Buffer 的准备
所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm  或 0.45 μm 滤膜过滤。
  结合/洗杂 Buffer：0. 15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
  洗脱 Buffer：0. 1M 甘氨酸，pH 3.0
  中和液：1M Tris-HCl ，pH8.5
1 / 5

 

2.2  样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样 品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用 0.22μm  或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效 率和防止堵塞柱子。
2.3  重力柱的装填
1.     取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2.     将 rprotein A Beads 混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占 悬液的一半) ,打开下出口流干保护液。
3.     加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4.     装入润洗后的上垫片，确保垫片与介质之前没有空隙，且保持水平。
5.     装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。
2.4  样品纯化
2.4.1  孵育法纯化
  根据纯化的样品量，取适量 rProtein A Beads 加入离心管中，1000 rpm 离心 1 min ，吸弃 上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
  向离心管中加入 5 倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm 离心 1 min ，吸弃上清；如 使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
  加入样品，封闭离心管或重力柱管，4  ℃振荡孵育 2-4 h 或者 37  ℃孵育 30 min-2h。
  孵育结束后，1000 rpm 离心 1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用 于电泳鉴定。
  用 5 倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm 离心 1 min 或重力柱管过滤，去除上清（注 意不要吸到介质），重复 3-5 次，中间建议更换新离心管。
  加入 3-5 倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育 5min, 1000 rpm 离心 1 min 或重力柱管 收集洗脱液，可重复 2-3 次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积 1 / 10 的中和液进行中和。
2.4.2  重力柱法纯化
  将蛋白A 层析介质装入合适的层析柱，层析用 5 倍柱体积的平衡 Buffer 进行平衡，使 介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复 2-3 次，起到保护蛋白的作用。
  将样品加到平衡好的层析介质中样品保留时间至少 2 min,保证样品和介质充分接触，收 集流出液，可以反复上样增加结合效率（保证目的蛋白与层析介质充分接触，提高目的 蛋白的回收率。
  用 10-15 倍柱体积的洗杂 Buffer 进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
  使用 5-10 倍柱体积的洗脱Buffer ，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既

2 / 5

 

可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需 要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积 1 / 10 的中和液进行中和。
注：上述步骤介质洗脱结束后，依次使用3 倍柱体积的结合 Buffer 和5 倍柱体积的去离子 水平衡介质，最后再用20%的乙醇冲洗 2 个柱体积，然后将介质置于 4 度保存。

2.5 SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
3.  层析介质清洗
本品可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流 速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对层析介质进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质
用 2 倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5 倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱体 积的 PBS ，pH 7.4 清洗。

4.    问题及解决方案
 

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	层析介质被堵塞	按照第3部分进行层析介质清洗
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议过滤
样品纯化过程中曲 线不稳	样品或buffer 中有气泡	去除样品或柱子中的气泡
		样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有 目 的蛋白	样品中抗体浓度太低	使用其抗原做配体的介质
	抗体被降解	适当的提高洗脱pH
回收率逐渐减低	上样量太多	减少上样量
	柱子太脏，载量降低	按照第3部分进行层析介质清洗

3 / 5

 

5.  抗体纯化介质一览表
 

蛋白A 层析介质 （普通型、高载量、特异性优良）	BDTL0001-1	1ml
	BDTL0001-5	5ml
	BDTL0001-25	25ml
	BDTL0001-100	100ml
蛋白A 重力预装柱套装	BDTL0001-K	套
蛋白A 高速层析介质（4FF） （高流速、高载量、特异性优良、耐压）	BDTL0002-5	5ml
	BDTL0002-25	25ml
	BDTL0002-100	100ml
蛋白A 高速层析介质（4FF）预装柱 （预装柱、高流速、高载量、配套 BioRad 和GE 等公司机器）	BDTL0002-11	1×1ml
	BDTL0002-51	5×1ml
	BDTL0002-15	1×5ml
	BDTL0002-55	5×5ml
	BDTL0002-3115	3×1ml+1×5ml
蛋白G 层析介质 （普通型、高载量、特异性优良）	BDTL0003-1	1ml
	BDTL0003-5	5ml
	BDTL0003-25	25ml
	BDTL0003-100	100ml
蛋白G 重力预装柱套装	BDTL0003-K	套
蛋白G 高速层析介质（4FF） （高流速、高载量、特异性优良、耐压）	BDTL0004-5	5ml
	BDTL0004-25	25ml
	BDTL0004-100	100ml
蛋白G 高速层析介质（4FF）预装柱 （预装柱、高流速、高载量、配套 BioRad 和GE 等公司机器）	BDTL0004-11	1×1ml
	BDTL0004-51	5×1ml
	BDTL0004-15	1×5ml
	BDTL0004-55	5×5ml
	BDTL0004-3115	3×1ml+1×5ml

附表  Protein A 和 Protein G 对不同抗体的结合能力
 

种属	亚型	Protein A  结合力	Protein G  结合力
Human	IgA	Variable	-
	IgD	-	-

4 / 5

 

	IgE	-	-
	IgG1	++++	++++
	IgG2	++++	++++
	IgG3	-	++++
	IgG4	++++	++++
	IgM	Variable	-
Avian egg yolk	IgY	-	-
Cow		++	++++
Dog		++	+
Goat		-	++
Guinea pig	IgG1	++++	++
	IgG2	++++	++
Hamster		+	++
Horse	Total IgG	++	++++
Koala		-	+
Liama		-	+
Monkey (rhesus)		++++	++++
Mouse	IgG1	+	++++
	IgG2a	++++	++++
	IgG2b	+++	+++
	IgG3	++	+++
	IgM	Variable	-
Pig		+++	+++
Rabbit	Total IgG	++++	+++
Rat	IgG1	-	+
	IgG2a	-	++++
	IgG2b	-	++
	IgG3	+	++
Sheep	Total IgG	+/-	++

++++：结合能力强； ++：结合能力中等；- ：结合能力弱或没有结合