产品介绍
    Ni Smart Beads 6FF是一种新型IMAC填料，螯合有非常牢固的Ni离子，具体性能见表1。Ni Smart Beads 6FF主要应用于分泌到真核培养液上清中的组氨酸标记蛋白的捕获和纯化，可以在含有EDTA及DTT的情况下进行目的蛋白高效的纯化。该介质同样能够应用于大肠杆菌胞内表达蛋白的纯化，而且其选择性更高，纯化获得的目的蛋白纯度更好。Ni Smart Beads 6FF有很强的组分兼容性，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件。
HisCap Smart 6FF是一种中压预装柱，有1ml和5 ml两种规格的预装柱，分别填装1ml和5ml Ni Smart Beads 6FF，共有5种不同包装规格的产品。预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户操作。

表1. HisCap Smart 6FF产品信息

项目	内容
规格	1ml	5ml
基质	高度交联的6%琼脂糖凝胶
载量	> 10 mg 6xHis-tagged protein/ml介质
粒径 (μm)	45-165
耐压	0.3 MPa, 1 bar
柱尺寸（内径×高度）	0.7x2.5 cm	1.6x2.5 cm
储存缓冲液	含20%乙醇的1xPBS
储存温度	4-30℃

表2.HisCap Smart 6FF试剂耐受情况

试剂种类	耐受时间
0.01 M HCl, 0.01 M NaOH	1 week
10 mM EDTA, 1 M NaOH,5 mM DTT,5 mM TCEP, 20 mM β-mercapyoethanol, 6 M GuHCI	24 hours
500 mM imidazole, 100 mM EDTA	2 hours
30% isopropanol	20min

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
    使用下列推荐Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。因为HisCap Smart 6FF可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需Buffer不同，具体配置方法见表3和表4。
表3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

名称	配方
Lysis Buffer	20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCI, pH 8.0
Wash Buffer	20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCI, 0-5 mM imidazole, pH 8.0
Elution Buffer	20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0

表4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

名称	配方
Lysis Buffer	20 mM NaH2PO4,  500 mM NaCI, 8MUrea , pH 8.0
Wash Buffer	20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCI, 8 M Urea，0-5 mM imidazole, pH 8.0
Elution Buffer	20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 8 M Urea，250 mM  imidazole, pH 8.0

注:为了减少宿主细胞蛋白的结合,建议在Wash Bufter中加入低浓度的咪唑。
为了消除一-些离子作用蛋白的吸附，可以在溶液中加入0.5-1.0 M NaCL
低pH洗脱会增加洗脱体积，请按需求进行选择。
2.2 样品准备
2.2.1 细菌或酵母表达可溶性蛋白 

1. 挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。
2. 表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7.000 rpm(7 ,500×g),离心15 min收集菌体，然后按照菌体: Lysis Buffer=1: 10 (W/V)加入Lysis Buffer,加入终浓度为1 mM的PMSF。加入溶菌酶(工作浓度为0.2-0.4 mg/ml,如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加溶菌酶)，(同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合)。
3. 将菌体沉淀悬浮起来，(如果菌液浓度高，也可考虑加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNaseI)，混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
4. 将澄清的破碎液转移至离心管中，10.000 rpm(15.000×g), 4°C离心 20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20°C保存。

2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞等真核细胞分泌表达可溶性蛋白 
1.   将细胞培养液转移至离心杯，7,000rpm(7 ,500×g)离心15min取上清。 
2.   样品中含有可耐受范围内试剂，不需要透析或浓缩，可以直接上样。
注:所有样品在过柱前，可以用0.22 um或者0.45 um滤膜过滤，防止柱子堵塞。
2.2.3包涵体蛋白纯化（变性条件）

1. 将培养液转移到离心杯中，7,000rpm(7 ,500×g)，离心15min收集菌体弃掉上清。
2. 按照菌体：Lysis buffer（不含8M尿素或6M盐酸胍）=1:10（W/V）将菌体悬浮起来，混匀，冰浴超声波破碎。
3. 将破碎液转移至离心管中，10,000rpm(15,00×g)，4℃离心20-30min，去掉上清,步骤2和3可以重复一次。
4. 按照菌体：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10（W/V）将包涵体悬浮起来。
5. 变性条件下进行His标签蛋白纯化.

2.3样品纯化流程
HisCap Smart 6FF是一种用于组氨酸标签蛋白纯化的预装柱产品，可以用各种常规的中压色谱系统，以AKTA仪器使用为例介绍HisCap Smart 6FF使用方法。。

1. 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中,并旋紧。
2. 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出存储缓冲液。
3. 使用至少5倍柱体积的平衡液平衡色谱柱。1 ml预装柱推荐流速为1 ml/min, 5ml 预装柱推荐流速为5 ml/min。
4. 利用样品泵或样品环上样。
   注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5. 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到-个稳定的基线(- 般至少10-15个柱体积)。注:在样品和结合缓冲液中加入咪唑可以提高样品纯度。
6. 用洗脱液采用等度或线性梯度洗脱。等度洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
7. 依次使用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水平衡填料,最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在20%的乙醇中，置于2-8C，防止填料被细菌污染。

2.4 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3. 在位清洗
    当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。
建议按照下面操作去除层析介质上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类 
方案一；通过使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20分钟可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱体积的去离子水清洗。
方案二；使用含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1–2 小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。
方案三；使用0.1M或0.5M NaOH溶液冲洗填料3个柱体积，然后用10-15倍柱体积的去离子水清洗。
去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl溶液清洗10-15分钟，再使用去离子水清洗10个柱体积。
清洗好的柱子可再用20%乙醇清洗2个柱体积，置于2-8℃保存。
5. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	填料被堵塞	按照第三部分对填料进行在位清洗。
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.2 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中无His标签蛋白	采用Western Blotting等确定样品中是否含有目的蛋白。
	表达量太低	优化表达条件。
	目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了	提高洗杂液的pH，或者降低咪唑浓度。
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	降低洗脱液的pH值，或者增加洗脱液中咪唑浓度。
	蛋白降解	在4°C下进行纯化操作。
		菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。
洗脱组分不纯（含有多种蛋白）	洗杂操作不彻底	增加洗杂液体积。
	样品中含有其他的组氨酸标签蛋白	通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件，再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度太高	4℃下进行上样。
	蛋白发生聚集	在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。