1.产品介绍
    Ni NTA高速层析介质（6FF）是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，配体与Ni层析介质（NTA）相同（产品结构见图1所示），具体性能见表1。Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的试剂条件（见表2）外，因其耐压的基质，可以耐受最高0.3 MPa的压力，更稳定，因此该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可以在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。
    Ni NTA高速层析介质（6FF）预装柱有1mL和5mL两种规格的预装柱，分别填装1mL和5mL Ni NTA高速层析介质（6FF），共有5种不同包装规格的产品。预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户操作。详细信息见表3。




图1. Ni IDA Beads，Ni NTA Beads和Ni NTA Beads FF化学结构示意图

项目	内容
规格	1ml	5ml
基质	高度交联的6%琼脂糖凝胶
载量	>40 mg 6×His-tagged protein/ml 基质
粒径 (μm)	45-165
耐压	0.3 MPa, 3 bar
柱尺寸（内径×高度）	0.7×2.5cm	1.6×2.5cm
储存缓冲液	含20% 乙醇的1×PBS
工作温度	4-30℃

试剂种类	浓度
还原剂	5 mM DTE 5 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
变性剂	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污剂	2% Triton™ X-100 (nonionic) 2% Tween™ 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他类	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
    使用下列推荐Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。因为Ni层析介质（NTA）可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需Buffer不同，具体配置方法见表3，表4和表5。


表3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
表4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，PH洗脱方式

名称	体积	配方
Lysis Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至8.0，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Wash Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea ） 100 mM NaH2PO4 （15.60g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至6.3，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Elution Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea ） 100 mM NaH2PO4 （15.60g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至4.5，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

表5. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，咪挫洗脱方式

名称	体积	配方
Lysis Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 10 mMimidazole （1.36 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Wash Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea ） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 20 mMimidazole （1.36 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Elution Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea ） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 250 mMimidazole （1.7 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0，使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

2.2 样品准备
2.2.1 细菌或酵母表达可溶性蛋白   2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白   2.2.3包涵体蛋白纯化（变性条件） 2.3  样品纯化 2.4 SDS-PAGE检测
3. 在位清洗
    当层析介质使用过程中发现反压过高或者层析介质上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。
建议按照下面操作去除层析介质上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
4. 层析介质再生
    His标签蛋白亲和纯化层析介质所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当层析介质使用过程中发现颜色变浅，或者层析介质载量明显变低时，需要进行对层析介质进行镍离子剥离和重新挂镍离子，也就是层析介质再生。将层析介质装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。 层析介质再生后，可以立即使用，也可以在等体积的20%的乙醇中，置于4-30℃保存。

5. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	层析介质被堵塞	按照3.在位清洗对层析介质进行在位清洗。
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.2 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	蛋白可能是包涵体，没有在上清中	可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。
	表达量太低	优化表达条件。
	目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了	提高wash Buffer的pH，或者降低咪唑浓度。
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。
		使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白。
	蛋白降解	在4°C下进行纯化操作。
		菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。
洗脱组分不纯（含有多种蛋白）	洗杂不彻底	增加Wash Buffer体积。
	样品中含有其他的组氨酸标签蛋白	通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件，再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
层析介质颜色变浅或变成白色	镍离子脱落或被剥离	按照4. 层析介质再生部分建议重新挂镍离子
层析介质呈现褐色	缓冲液中含有DTT等还原剂	参考表2，适当降低还原剂的浓度，或者改用巯基乙醇。
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度太低	4°C下进行上样。
	蛋白发生聚集	在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。