1.产品介绍
Ni层析介质（NTA）是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA），螯合镍离子（Ni2+）后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻（产品结构见图1所示，三种产品结构的区别），更加稳定，具体性能见表1。Ni层析介质（NTA）可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件（见表2），适用性更广，配体更稳定，选择性更高。
图1. Ni IDA Beads，Ni NTA Beads和Ni NTA Beads FF化学结构示意图
表1. Ni层析介质（NTA）产品性能
| 项目 |
性能 |
| 基质 |
4%琼脂糖凝胶 |
| 载量（/ml基质） |
>40mg 6×His-tagged protein |
| 微球粒径（μm） |
45–165 |
| 最大压力 |
0.1 MPa, 1 bar |
| 储存缓冲液 |
20% 乙醇1X PBS |
| 工作温度 |
4°C-30°C |
表2. Ni层析介质（NTA）可耐受试剂及浓度
| 试剂种类 |
浓度 |
| 还原剂 |
5 mM DTE
5 mM DTT
20 mM β-mercaptoethanol
5 mM TCEP
10 mM reduced glutathione |
| 变性剂 |
8 M urea
6 M Gua-HCl |
| 去污剂 |
2% Triton™ X-100 (nonionic)
2% Tween™ 20 (nonionic)
2% NP-40 (nonionic)
2% cholate (anionic)
1% CHAPS (zwitterionic) |
| 其他类 |
500 mM imidazole
20% ethanol
50% glycerol
100 mM Na2SO4
1.5 M NaCl
1 mM EDTA
60 mM citrate |
注：如果溶液中含有上述两种以上的试剂，介质的耐受性能可能会进一步下降。
2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
可使用下列推荐Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。因为Ni层析介质（NTA）可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需Buffer不同，具体配置方法见表3，表4和表5。
表3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
| 名称 |
体积 |
配方 |
Lysis Buffer
|
1L |
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
10 mM imidazole （0.68 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
Wash Buffer
|
1L |
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
20 mM imidazole（1.36 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
| Elution Buffer |
1L |
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
250 mM imidazole （17.0 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
表4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，pH洗脱方式
| 名称 |
体积 |
配方 |
| Lysis Buffer |
1L |
8 M Urea （480.50 g urea）
100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）
使用盐酸溶液调节pH至8.0
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
| Wash Buffer |
1L |
8 M Urea （480.50 g urea ）
100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）
使用盐酸溶液调节pH至6.3
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
| Elution Buffer |
1L |
8 M Urea（480.50 g urea）
100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl（15.76 g Tris·HCl）
使用盐酸溶液调节pH至4.5
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
表5. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，咪唑洗脱方式
| 名称 |
体积 |
配方 |
| Lysis Buffer |
1L |
8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
10 mM imidazole （0.68 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
| Wash Buffer |
1L |
8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
20 mM imidazole （1.36 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
| Elution Buffer |
1L |
8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
250 mM imidazole （17.0 g imidazole）
使用NaOH溶液调节pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。 |
2.2 样品准备
2.2.1 细菌或酵母表达可溶性蛋白
1.挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。
2.表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000rpm(7500 ×g)离心15min收集菌体，然后按照菌体：Lysis Buffer=1：10（W/V）加入Lysis Buffer，加入最终浓度为1mM的PMSF。加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS 或pLysE，可以不加溶菌酶），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与层析介质的结合。
3.将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNaseA和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
4.将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm(15000 ×g) 4℃离心20-30分钟。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白
1.将细胞培养液转移至离心杯，5,000rpm(3800 ×g)离心10min，收集菌体得上清，如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，蛋白还需用Lysis Buffer 下透析才能加入柱子。
2.对于大体积上清，需加硫酸铵沉淀浓缩，蛋白还需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。
2.2.3包涵体蛋白纯化（变性条件）
1.将培养液转移到离心杯中，7,000rpm(7500 ×g)，离心15min收集菌体弃掉上清。
2.按照菌体：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10（W/V）将菌体悬浮起来，混匀，冰浴超声波破碎。
3.将破碎液转移至离心管中，10,000rpm(15000 ×g)下4℃离心20-30min，去掉上清,步骤2和3可以重复一次。
4.按照菌体：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10（W/V）将包涵体悬浮起来。
5.变性条件下进行His标签抗体纯化，具体缓冲液配方见表4，表5。
2.3Ni NTA Beads 重力柱的装填
1.取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2.将Ni NTA Beads混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
3.加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4.装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5.装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4-30℃保存。
2.4样品纯化
2.4.1 孵育法纯化
1.根据纯化的样品量，取适量层析介质加入离心管中，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
2.向离心管中加入5倍介质体积的Lysis buffer清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis buffer；重复两次以上。
3.加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
4.孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
5.用5倍介质体积的Wash Buffer清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。必要时可以调整咪唑的浓度进行洗杂。
6.加入3-5倍柱体积的Elution Buffer进行洗脱，室温孵育10-15min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。
2.4.2 重力柱法纯化
1.将装填好的层析介质重力柱，用5倍柱体积的Lysis buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复2-3次。
2.将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3.用10-15倍柱体积的Wash Buffer进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。必要时可以调整咪唑的浓度进行洗杂。
4.使用5-10倍柱体积的Elution Buffer洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
注：上述步骤介质洗脱结束后，先用Lysis buffer冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%的乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于4度保存。
2.4 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3. 在位清洗
当层析介质使用过程中反压过高或层析介质上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗（Cleaning-in-Place, CIP）。
建议按照下面操作去除层析介质上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
通过使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20分钟可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，清洗层析介质2倍柱体积。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1–2小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。
去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl溶液接触时间为10-15分钟清洗。然后，再使用去离子水清洗10个柱体积。
4. 层析介质再生
组氨酸标签蛋白亲和纯化层析介质所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当层析介质使用过程中发现颜色变浅，或者层析介质载量明显变低时，需要进行对层析介质进行镍离子剥离和重新挂镍离子，也就是层析介质再生。将层析介质装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。
1.使用去离子水清洗5倍柱体积；
2.使用5倍柱体积100 mM EDTA (pH 8.0)剥离镍离子；
3.使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
4.使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积,停留10-15min；
5.使用去离子水清洗填料，直至pH中性；
6.使用3-5倍柱体积100 mM NiSO4再生挂镍；
7.使用10倍柱体积去离子水清洗；
再生的层析介质，可以立即使用，如不立即使用，需将层析介质悬浮于等体积的20%的乙醇中，置于4-30°C保存。
5. 问题及解决方案
| 问题 |
原因分析 |
推荐解决方案 |
| 柱子反压过高 |
层析介质被堵塞 |
按照3.对层析介质的在位清洗。 |
| 裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.2 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。 |
| 样品太粘稠 |
样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。 |
| 缓冲液太粘稠 |
有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 |
| 洗脱组分中没有目的蛋白 |
蛋白可能是包涵体，没有在上清中 |
可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。 |
| 表达量太低 |
优化表达条件。 |
| 目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了 |
提高wash Buffer的pH，或者降低咪唑浓度。 |
| 目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来 |
降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。 |
| 使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白。 |
| 蛋白降解 |
在4°C下进行纯化操作。 |
| 菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。 |
| 洗脱组分不纯（含有多种蛋白） |
洗杂不彻底 |
增加Wash Buffer体积。 |
| 样品中含有其他的组氨酸标签蛋白 |
通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。 |
| 层析介质颜色变浅或变成白色 |
镍离子脱落或被剥离 |
按照4.层析介质再生中的建议重新挂镍离子 |
| 层析介质呈现褐色 |
缓冲液中含有DTT等还原剂 |
适当降低还原剂DTT的浓度至2mM以下，或者改用巯基乙醇。 |
| 上样过程中蛋白发生沉淀 |
操作温度太高 |
4℃下进行上样。 |
| 蛋白发生聚集 |
在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。 |
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