1.  产品介绍
       Butyl-4FF 、 Octyl-4FF 、Phenyl  LS-6FF  和 Phenyl  HS-6FF  都 属 于 疏 水层 析介 质 （Hydrophobic Interaction Chromatography，简称 HIC），主要通过分子表面疏水性差别进行 分离纯化的一类疏水层析介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质和多肽的分离纯 化。本产品均可耐受较高的流速及更高的化学稳定性，适合实验室及工业大规模纯化。
Butyl-4FF
       属于脂肪族疏水作用介质，配基通过不带电和化学性质十分稳定的醚键连接到琼脂糖 微球上，具体性能见表 1。
表 1. Butyl-4FF 产品性能

性能	指标
基质	高度交联的 4%琼脂糖微球
配体密度	丁基
载量(/ml 介质)	约 7mg lgG; ＞26mg BSA
粒径 (μm)	45-165
流速 (cm/h)	300
pH  稳定范围	3-13
储存缓冲液	20%  乙醇
储存温度	4-30℃

Octyl-4FF
属于脂肪族疏水作用介质，配基通过不带电和化学性质十分稳定的醚键连接到琼脂糖微 球上，具体性能见表 2。
表 2. Octyl-4FF 产品性能

性能	指标
基质	高度交联的 4%琼脂糖微球
配体	辛基
载量(/ml 介质)	约 26mg lgG; ＞26mg BSA
粒径 (μm)	45-165
流速	300cm/h
pH  稳定范围	3-13
储存缓冲液	20%  乙醇
储存温度	4-30℃

Phenyl LS-6FF, Phenyl HS-6FF
Phenyl LS-6FF(Low Sub)  和 Phenyl HS-6FF(High  Sub)分别是低取代的芳香族疏水层析 介质和高取代的芳香族疏水层析介质，其中苯基通过不带电、化学性质稳定的醚键连接至高 度交联的 6%琼脂糖微球上。可根据不同物质的分离要求、分离效率和结合载量不同来选择 高取代或低取代的苯基疏水层析介质，具体性能见表 3。
表 3. Phenyl LS-6FF 和 Phenyl HS-6FF 产品性能

性能	指标
基质	高度交联的 6%琼脂糖微球
配体	苯基
载量(/ml 介质)	Low Sub :约 10mg lgG  、＞24mg BSA High Sub :约 30mg lgG  、＞36mg BSA
粒径 (μm)	45-165
流速	300-600cm/h
pH  稳定范围	3-13
储存缓冲液	20%  乙醇
储存温度	4-30℃

2.  纯化流程
2.1 Buffer 的准备

所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。 平衡/洗杂液：0.05M 磷酸盐，1.7M 硫酸铵，pH7.0
洗脱液：0.05M 磷酸盐，pH7.0
注：疏水层析介质缓冲液可根据不同介质及纯化物质不同做适当改变，原则上市高盐上 样低盐洗脱。


2.2  样品准备
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效 率和防止堵塞柱子。
样品中盐浓度跟平衡液相同，通常为 0.5-2.0M 硫酸铵。

2.3  介质装填
2.3.1 重力柱的装填
下面以 Butyl Beads 4FF 为例介绍填装重力柱的方法。
1.     取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2.     将Butyl Beads4FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的一半)，打开下出口流干保护液。
3.     加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4.     装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5.     装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4-30℃保存。


2.3.2 中压层析柱的装填
Butyl-4FF、Octyl-4FF、Phenyl LS-6FF 和 Phenyl HS-6FF 被广泛应用于工业纯化，因此， 
涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面以 Butyl Beads 4FF 为例介绍填装层析柱的方法。
装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下:
V=1.15πr²h
V:所需介质体积ml
1.15:压缩系数
r:柱管半径 cm
h:装填高度cm
注意:所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
1.     用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2.     将填料悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3.     如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置干浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4.     打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速。这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意:在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5.     关闭泵，关闭层析柱出口。
6.     如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7.     将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8.     将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
2.4  样品纯化
2.4.1 孵育法纯化
根据纯化的样品量，取适量Butyl Beads 4FF加入离心管中，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育10-15min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1 / 10的中和液进行中和。


2.4.2 重力柱法纯化
将装填好的Butyl Beads 4FF重力柱用5倍柱体积的平衡Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复2-3次。
将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
2.4.3中压层析柱法纯化
Butyl Beads 4FF 装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积的洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。
上述步骤介质洗脱结束后，先用平衡液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8C保存。
注：疏水作用随着温度的降低而降低。可采用非极性有机溶剂如 40-50%乙二醇、30%  异丙醇或 1%去污剂（Triton X-100）洗脱。不同离子盐溶与盐析作用强弱不同，如下图



2.4 SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
3.  层析介质清洗
疏水层析层析介质每次使用后可以用分别用 2-3 倍柱体积的 30%异丙醇、3 倍去离子水清洗， 然后用至少 3 倍柱体积的 Buffer 进行平衡。
CIP（Cleaning In Place）清洗
疏水层析层析介质可以重复使用，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造 成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对层析介质进行 CIP 清洗。
去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法
用 2 倍柱体积的 1M NaOH 溶液进行清洗（至少浸泡 4 小时），用 3-4 倍柱体积的去离 子水清洗,  然后用至少 3 倍柱体积的平衡液进行平衡。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 3-4 倍柱体积的 1% Triton X-100 的 0.1M 醋酸盐清洗（至 少 1-2 小时），用 3-4 倍柱体积的去离子水清洗,  然后用至少 3 倍柱体积的平衡液进行平衡。