产品基本信息

• 产品货号 BDTL0014
• 别名 Streptavidin高速层析介质(6FF) Streptavidin Beads 6FF
• 产品名称 Streptavidin高速层析介质(6FF) Streptavidin Beads 6FF
• 类别 纯化试剂

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产品详情

货号	规格
BDTL0014-5	5ml
BDTL0014-25	25ml
BDTL0014-100	100ml

1.  产品介绍
Streptavidin 高速层析介质（6FF）利用生物素与链霉亲和素配体之间的相互作用纯化生 物素或生物素化的蛋白、抗体等物质。链霉亲和素与生物之间的亲和力很强，需要在变性条 件下洗脱，链霉亲和素对亚氨基生物素的亲和力相对较弱，可以在 pH9.5-11.0 结合，pH4.0 时洗脱，不需要使用变性剂所以能更好的保持亲和素偶联物的活性。 Streptavidin  高速层析 介质（6FF）采用高交联的 6%琼脂糖介质，可耐受较高的流速及化学稳定性，适合大规模 纯化。具体性能见表 1。
表 1. Streptavidin 高速层析介质（6FF）产品性能
 

性能	指标
基质	高度交联的 6%琼脂糖微球
配体	链霉亲和素
载量	>200nmol Biotin /ml 介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.3 MPa, 3 bar
pH  稳定范围	4-9
储存缓冲液	含20% 乙醇1X PBS
储存温度	2-8℃

2.  纯化流程
2.1 Buffer 的准备
所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。
生物素或生物素化物质的纯化
  平衡/洗杂 Buffer: 20mM NaH₂PO₄, 0.15M NaCl, pH7.4
  洗脱 Buffer: 8M 盐酸胍, pH1.5
亚氨基生物素标签物质的纯化
  平衡/洗杂 Buffer: 50mM 碳酸铵, 0.5M NaCl, pH10.0
  洗脱 Buffer: 50mM 碳酸铵, 0.5M NaCl, pH4.0

2.2  样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值，可以用平衡/洗涤缓冲液对血清样 品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效 率和防止堵塞柱子。
2.3 层析介质装填
2.3.1 重力柱的装填
1.取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2.将层析介质混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
3.加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4.装入润洗后的上垫片，确保垫片与层析介质之前没有空隙，且保持水平。
5.装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡。暂不使用时则加入保护液，2-8℃保存。
2.3.2 中压层析柱的装填
Streptavidin 高速层析介质（6FF）被广泛用于工业纯化，因此，涉及到各种中低压色谱层析柱的装填，下面介绍填装层析介质的方法。
装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：
V=1.15πr²h
V: 所需介质体积 ml
1.15: 压缩系数
r: 柱管半径 cm
h: 装填高度 cm
注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。

1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2. 将层析介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3. 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4. 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液 压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5. 关闭泵，关闭层析柱出口。
6. 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7. 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8. 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.4 样品纯化
2.4.1 孵育法纯化

1. 根据纯化的样品量，取适量Streptavidin 高速层析介质（6FF）加入离心管中，1000rpm离心1min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
2. 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
3. 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
4. 孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
5. 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
6. 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次

2.4.2 重力柱法纯化

1. 将装填好的重力柱用5倍柱体积的平衡Buffer进行平衡，使层析介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复2-3次。
2. 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3. 用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4. 使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。

2.4.3中压层析柱法纯化
中压层析柱装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1. 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
2. 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
3. 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
4. 利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5. 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
6. 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

注:上述步骤介质洗脱结束后，先用平衡液冲洗5-10倍柱体积，然后用纯水冲洗5-10倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
3.  层析介质清洗
Streptavidin 高速层析介质（6FF）可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋 白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对层析介质 进行清洗。
  去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法
用 2 倍柱体积的0.1M NaOH 或 6M 盐酸胍或 8M 尿素溶液进行清洗，然后立即用5 倍 柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。
  去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4 倍柱体积的70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱 体积的 PBS, pH 7.4 清洗。
4.  订购信息及相关产品
 

名称	货号	规格
Streptavidin 高速层析介质（6FF）	BDTL0014-5	5ml
	BDTL0014-25	25ml
	BDTL0014-100	100ml
Streptavidin 高速层析介质（6FF）预装柱	BDTL0014-11	1×1ml
	BDTL0014-51	5×1ml
	BDTL0014-15	1×5ml
	BDTL0014-55	5×5ml
	BDTL0014-3115	3×1ml+1×5ml