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蛋白A重力预装柱套装 AbPur rProtein A Kit

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货号: BDTL0001-K

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产品基本信息

  • 产品货号 BDTL0001-K
  • 别名 蛋白A重力预装柱套装
  • 产品名称 蛋白A重力预装柱套装 AbPur rProtein A Kit
  • 类别 纯化试剂

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产品详情

1.产品介绍
本品是用于分离和纯化单克隆抗体的通用性亲和层析介质，主要性能见下表。蛋白A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG，但是不与狗lgG结合，不结合人lgM、lgD和IgA。蛋白A与蛋白G与不同来源及亚类的免疫球蛋白结合能力不一样（见附表）。天然蛋白A有五个IgG结合区域和一些未知功能的区域，重组蛋白A去除了与白蛋白及细胞表面结合位点，只含有五个IgG结合区域，减少了非特异性吸附。
蛋白A层析介质性能表
指标 性能
基质 4%琼脂糖微球
配体 重组蛋白A
载量 >40mg人lgG/ml介质
粒径 (μm) 45-165
最大流速 0.1 MPa, 1 bar
pH 稳定范围 3-12
储存缓冲液 20%乙醇 1×PBS
储存温度 2-8℃
  1. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45 μm滤膜过滤。
  • 结合/洗杂Buffer：0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
  • 洗脱Buffer：0.1M甘氨酸，pH 3.0
  • 中和液：1M Tris-HCl，pH8.5


2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2.3 重力柱的装填
1） 取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2） 将rprotein G Beads混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半) ,打开下出口流干保护液。
3） 加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4） 装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5） 装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。
2.4 样品纯化
2.4.1 孵育法纯化
  • 根据纯化的样品量，取适量rProtein G Beads加入离心管中，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
  • 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
  • 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
  • 孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
  • 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
  • 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1 / 10的中和液进行中和。
2.4.2 重力柱法纯化
  • 将蛋白G层析介质装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，重复2-3次，起到保护蛋白的作用。
  • 将样品加到平衡好的层析介质中样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率（保证目的蛋白与层析介质充分接触，提高目的蛋白的回收率。
  • 用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
  • 使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1 / 10的中和液进行中和。
注：上述步骤介质洗脱结束后，依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用20%的乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于4度保存，防止填料被细菌污染。
2.5 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3. 层析介质清洗
本品可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对层析介质进行清洗。
  • 去除一些沉淀或变性物质
用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
  • 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。
  1. 问题及解决方案
问题 原因分析 推荐解决方案
柱子反压过高 筛板被堵塞 清洗或更换筛板
层析介质被堵塞 按照第3部分进行层析介质清洗
裂解液中含有微小的固体颗粒，建议过滤
样品纯化过程中曲线不稳 样品或buffer中有气泡 去除样品或柱子中的气泡
样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白 样品中抗体浓度太低 使用其抗原做配体的介质
抗体被降解 适当的提高洗脱pH
回收率逐渐减低 上样量太多 减少上样量
柱子太脏，载量降低 按照第3部分进行层析介质清洗
5. 抗体纯化介质一览表
通用性抗体纯化产品
蛋白A层析介质
（普通型、高载量、特异性优良）		 BDTL0001-1 1ml
BDTL0001-5 5ml
BDTL0001-25 25ml
BDTL0001-100 100ml
蛋白A重力预装柱套装
（内含1支3ml重力预装柱，以及3次量的缓冲液）		 BDTL0001-K 套
蛋白A高速层析介质（4FF）
（高流速、高载量、特异性优良、耐压）		 BDTL0002-5 5ml
BDTL0002-25 25ml
BDTL0002-100 100ml
蛋白A高速层析介质（4FF）预装柱
（预装柱、高流速、高载量、配套BioRad和GE等公司机器）		 BDTL0002-11 1×1ml
BDTL0002-51 5×1ml
BDTL0002-15 1×5ml
BDTL0002-55 5×5ml
BDTL0002-3115 3×1ml+1×5ml
蛋白G层析介质
（普通型、高载量、特异性优良）		 BDTL0003-1 1ml
BDTL0003-5 5ml
BDTL0003-25 25ml
BDTL0003-100 100ml
蛋白G重力预装柱套装
（内含1支3ml重力预装柱，以及3次量的缓冲液）		 BDTL0003-K 套
蛋白G高速层析介质（4FF）
（高流速、高载量、特异性优良、耐压）		 BDTL0004-5 5ml
BDTL0004-25 25ml
BDTL0004-100 100ml
蛋白G高速层析介质（4FF）预装柱
（预装柱、高流速、高载量、配套BioRad和GE等公司机器）		 BDTL0004-11 1×1ml
BDTL0004-51 5×1ml
BDTL0004-15 1×5ml
BDTL0004-55 5×5ml
BDTL0004-3115 3×1ml+1×5ml
蛋白A/G高速层析介质（4FF）
（用于IP、Co-IP实验）		 BDTL0021-5 5ml
BDTL0021-25 25ml
BDTL0021-200 200ml
蛋白L层析介质
（结合更广泛来源及亚类的抗体）		 BDTL0022-5 5ml
BDTL0022-25 25ml
BDTL0022-200 200ml
单克隆抗体纯化产品
蛋白A高速耐碱层析介质（4FF）
（耐碱、高流速、高载量、特异性优良、耐压、高稳定性）		 BDTL0005-10 10ml
BDTL0005-100 100ml
BDTL0005-500 500ml
蛋白A高速耐碱层析介质（4FF）预装柱
（预装柱、耐碱、高流速、高载量、耐压、高稳定性、配套BioRad和GE等公司机器）		 BDTL0005-11 1×1ml
BDTL0005-51 5×1ml
BDTL0005-15 1×5ml
BDTL0005-55 5×5ml
BDTL0005-3115 3×1ml+1×5ml
多克隆抗体纯化产品
预活化层析介质（抗原偶联专用）
（预活化层析介质，可以和氨基、巯基反应，用来偶联蛋白、核酸、小分子等。适合偶联抗原纯化多克隆抗体）		 BDTL0006-5 5ml
BDTL0006-25 25ml
BDTL0006-100 100ml
亲硫层析介质
（快速从血清、腹水或组织培养液中纯化抗体）		 BDTL0025-5 5ml
BDTL0025-10 10ml
BDTL0025-50 50ml
BDTL0025-250 250ml

附表  Protein A和Protein G对不同抗体的结合能力
种属 亚型 Protein A 结合力 Protein G 结合力
Human IgA Variable -
IgD - -
IgE - -
IgG1 ++++ ++++
IgG2 ++++ ++++
IgG3 - ++++
IgG4 ++++ ++++
IgM Variable -
Avian egg yolk IgY - -
Cow   ++ ++++
Dog   ++ +
Goat   - ++
Guinea pig IgG1 ++++ ++
IgG2 ++++ ++
Hamster   + ++
Horse   ++ ++++
Koala   - +
Liama   - +
Monkey (rhesus)   ++++ ++++
Mouse IgG1 + ++++
IgG2a ++++ ++++
IgG2b +++ +++
IgG3 ++ +++
IgM Variable -
Pig   +++ +++
Rabbit No distinction ++++ +++
Rat IgG1 - +
IgG2a - ++++
IgG2b - ++
IgG3 + ++
Sheep   +/- ++
++++：结合能力强； ++：结合能力中等；-：结合能力弱或没有结合
 

文献引用 (1)

产品问答

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Q1: 本产品可以重复使用几次？蛋白的回收率有多少？

Q2: 3ml的重力预装柱套装一次性最多能加多少样品

Q3: 填料离心力是多少

Q4: 我的纯化没富集到抗体，流穿和洗洗杂、洗脱液，可以再拿去过一遍柱子吗？

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