产品基本信息

• 产品货号 BDAB0158
• 产品名称 SARS-CoV-2(2019-nCoV) Surrogate Virus Neutralization定量试剂盒
• 类别 病原微生物抗原抗体假病毒
• 注意事项 新冠中和抗体试剂盒

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产品详情

描述（description）
本试剂盒基于中和 ELISA 分析技术，将 RBD 蛋白预先包被在酶标板上，之后将阳性对照标准品、阴性对照和分析样本分别加入到微孔中反应，再加入HRP标记的ACE2蛋白，样本中的RBD中和抗体会阻断RBD和ACE2之间的相互作用，清洗掉未结合的试剂，将显色底物溶液添加到微孔中显色，显色强度与样本中的RBD中和抗体浓度成反比。
本试剂盒用于测定血清和血浆样本RBD中和抗体的浓度。

稳定性&储存（Stability &Storage）
收到试剂盒后请将标准品、检测溶液 A、阳性对照、阴性对照以及预包板保存于-20℃，封板膜放置于常温保存,其余试剂请置于 4 ℃保存备用。
  试剂盒按推荐温度保存6个月，信号强度降低小于 10%。

使用方法（Standard Operating Procedure）
所需设备及试剂
450 nm滤光片酶标仪，含540 nm或570nm校正波长更佳
单道或多道微量移液器，移液器枪头
去离子水
500 mL量筒
样品稀释管或不同规格EP管
吸水纸
微孔板振荡仪（可选）

一、样品收集与储存
处理所有的血液和血清，请按照NCCLS提供的处理和储存血清和血浆样本的建议（1990年H18-A批准的血液样本处理和处理标准程序）。
1.血清样本：全血室温放置60分钟或4℃过夜，然后1000 x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。
2.血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆，样品采集后30分钟内1000 x g离心15分钟，取上清检测，或分装后于≤-20℃冰箱保存，避免样品反复冻融。

二、试剂准备
使用前将所有试剂和样本置于室温平衡。
1.20×浓缩清洗液：如果浓缩清洗液中有晶体析出，平衡至室温并摇匀，直到晶体完全溶解，25mL浓缩清洗液使用去离子水定容至500mL，得到清洗工作液。
2.血清、血浆样本：推荐血清，血浆使用样本稀释液 1:9稀释后上样，例如10μL样本加入90μL样本稀释液。如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中抗体浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。
3.标准品工作液：阳性对照临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，使用样本稀释液1:100稀释得到第一个标准点10ug/mL，依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点      10μg/mL、 5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL，最后再以阴性对照工作液为零标准（0 μg/mL），共计8个标准点，建议每个标准点至少做2个平行孔。
4.阴性对照工作液：阴性对照临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，使用样本稀释液1:9稀释至工作浓度，例如10μL阴性对照加入90μL样本稀释液。
5.检测溶液A工作液：检测溶液A临用前震荡混匀后用掌上离心机瞬时离心，使液体集中于管底，使用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。
6.显色液：避光保存，显色时100μL /孔。 
7.终止液：显色完毕后50μL /孔。

三、实验步骤
使用前将所有试剂和样本置于室温，建议对所有标准品和待测样本进行一式两份的分析。
1. 按照前面章节的指示准备所有试剂和样本。 
2. 从板架上取下多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。
3. 每孔分别加入50μL稀释好的标准品工作液、阴性对照工作液和待测样本，用封板膜封住，37℃孵育30分钟。
4. 每孔分别加入50μL稀释好的检测溶液A工作液，用封板膜封住，使用微孔板振荡仪或手动轻微震荡5分钟后，37℃孵育1小时。
5. 弃去孔内液体，每孔加入 300μL的清洗工作液，轻微震荡后弃去孔内液体，将酶标板倒扣在吸水纸上轻拍，使残留在孔内的液体全部去除，重复洗板 5 次，此过程也可采用尖嘴喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。
6. 每孔加入100μL显色液，37℃避光显色8-10分钟。
7. 每孔加入50μL终止液，孔里的颜色应该由蓝色变至黄色，如果孔内颜色为绿色或颜色变化不均匀，轻轻震动酶标板使颜色均一。
8. 擦干酶标板底部水气，立刻用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的O.D.值，如果波长校正可用，则设置为540 nm或570 nm，如果波长校正不可用，则从450 nm的读数中减去540 nm或570 nm的读数，这种修正可去除酶标板读数中的光学偏差，如果没有校正波长，可直接读取450 nm的读数，但读值有可能不准确。

四、标准曲线制作



取每个标准品、阴性对照、样本的复孔平均值 O.D.，然后计算抑制率，抑制率计算公式如下：以标准品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，选取抑制率在10%-90%区间的4-5点绘出标准曲线（R2值越趋近于1曲线越精确），然后再将待测样本的抑制率代入标准曲线的回归方程式计算出浓度，从标准曲线上计算出的浓度须乘以稀释倍数，即可计算出待测样本RBD中和抗体实际浓度。
如果样本检测值超出标准曲线范围，可适当调整稀释倍数并重新测定，或预估样本中抗体浓度，在实验之前预先稀释数个梯度同时进行测定。

五、标曲案例
标准曲线仅用于演示，每次实验均需生成单独的标准曲线。

标准点（ug/ml）	O.D.	抑制率
10	0.06	97.08%
5	0.11	94.41%
2.5	0.29	85.18%
1.25	0.84	56.44%
0.625	1.44	25.53%
0.3125	1.76	9.04%
0.15625	1.72	10.96%
阴性对照	1.94	/

六、检测范围
0.15625ug/mL—10ug/mL

七、精密度
批内差：CV<12%
批间差：CV<15%

八、稳定性
试剂盒按推荐温度保存6个月，信号强度降低小于 10%。

九、实验细节说明
1.在试剂盒标签上的有效期内使用，不要与其他厂家的试剂盒混合使用。
2.如果阴性对照或阳性对照检测OD值超出检测范围，可适当缩短显色时间。
3.为避免交叉污染，不同标准品、样本、试剂的加样需更换移液枪头，每管试剂使用单独的容器储存。
4.在孵育过程中贴紧封板膜。
5.显色液避光保存，临用前15分钟从冰箱取出室温平衡。
6.浓缩清洗液（20×）需使用去离子水1：20稀释至工作浓度，去离子水不包含在试剂盒中，需实验人员自备。
7.终止液为酸性溶液，具有轻微腐蚀性，使用时避免接触皮肤、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接触，使用大量清水冲洗后观察接触部位反应，如情节严重请及时就医。
8.试剂盒酶标板条可按需拆卸使用，已开封的试剂盒建议在1个月内使用，未开封的试剂盒所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存，收到试剂盒后请将阳性对照、阳性对照、检测溶液 A以及 96 孔板保存于-20℃，其余试剂请置于 4 ℃保存备用。


十、常见问题解决指南

问题	原因	解决方案
标准曲线差	移液不精确	检查和校正移液器
	标准品准备不正确	进行正确的标准品梯度稀释
O.D 值低	孵育时间太短	保证充足的孵育时间
	温度不正确	试剂平衡至室温并保证孵育温度正确
	试剂体积不正确	检查移液器并确保加样体积与说明书一致
精密度低	移液不精确	检查和校正移液器
	混匀不充分	充分混匀和吸取试剂
	洗涤不充分	按说明书要求充分洗涤和浸泡
背景值高	洗涤不充分	按说明书要求充分洗涤和浸泡
	清洗液污染	重新配置清洗液
灵敏度低	试剂盒储存不当	试剂盒短期整体保存于4℃，长期保存根据说明书分开保存各组分

组分和说明（Component and Instruction）
样品清单及储存条件

样品名称	规格	描述	推荐储存条件
预包板	1 板	96孔聚苯乙烯微孔板（12列*8孔），预包被RBD蛋白。	密封状态放置于-20℃保存。
阳性对照	1 管	12L重组人源RBD中和抗体，浓度 1mg/mL,临用前用样本稀释液配置7个标准点。	放置于-20℃保存。
阴性对照	1 管	60L阴性对照，临用前用样本稀释液1:10 稀释至工作浓度。	放置于-20℃保存。
检测溶液A	1 管	12L HRP标记 ACE2 蛋白（含防腐剂），临用前用检测溶液稀释液1:2000稀释至工作浓度。	放置于-20℃保存。
样本稀释液	1 瓶	25 mL稀释液（含防腐剂），用于阳性对照、    阴性对照、血清、血浆的稀释。	放置于4℃保存。
检测溶液稀释液	1 瓶	25 mL稀释液（含防腐剂），用于检测溶液A的稀释。	放置于4℃保存。
浓缩清洗液	1 瓶	25 mL （20×）浓缩清洗液（含防腐剂）， 临用前用去离子水1:20稀释至工作浓度。	放置于4℃保存。
显色液	1 瓶	12 mL TMB（四甲基联苯胺）。	放置于4℃保存。
终止液	1 瓶	6 mL 2M 酸液。	放置于4℃保存。
封板膜	4 片	用于实验中封闭酶标板。	放置于常温保存。

  *在试剂盒保质期内使用

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For research use only .