1.产品介绍
Ni层析介质（NTA）是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA），螯合镍离子（Ni2+）后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构保护了镍离子免受小分子的进攻（产品结构见图1所示，三种产品结构示意图），更加稳定，具体性能见表1。Ni层析介质（NTA）可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件（见表2），适用性更广，配体更稳定，选择性更高。
本套装提供3ml Ni层析介质（NTA）重力预装柱，组氨酸标签蛋白纯化所需的缓冲液，方便客户使用，操作简单，纯化效率高。试剂盒详细组分见表3。
图1. Ni NTA Beads产品化学结构示意图
表1. Ni层析介质（NTA）产品性能
| 项目 |
性能 |
| 基质 |
4%琼脂糖凝胶 |
| 载量（/ml基质） |
>40mg 6×His-tagged protein |
| 微球粒径（μm） |
45–165 |
| 最大压力 |
0.1 MPa, 1 bar |
| 储存缓冲液 |
20% 乙醇的1XPBS |
| 工作温度 |
2-8℃ |
表2. Ni层析介质（NTA）可耐受试剂及浓度
| 试剂种类 |
浓度 |
| 还原剂 |
5 mM DTE
1 mM DTT
20 mM β-mercaptoethanol
5 mM TCEP
10 mM reduced glutathione |
| 变性剂 |
8 M urea
6 M Gua-HCl |
| 去污剂 |
2% Triton™ X-100 (nonionic)
2% Tween™ 20 (nonionic)
2% NP-40 (nonionic)
2% cholate (anionic)
1% CHAPS (zwitterionic) |
| 其他类 |
500 mM imidazole
20% ethanol
50% glycerol
100 mM Na2SO4
1.5 M NaCl
1 mM EDTA
60 mM citrate |
注：如果溶液中含有上述两种以上的试剂，介质的耐受性能可能会进一步下降。
2.纯化流程
2.1 样品准备
2.1.1 细菌或酵母表达可溶性蛋白
1.挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。
2.表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000rpm(7500 ×g)离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的Lysis Buffer，加入最终浓度为1mM的PMSF。加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS 或pLysE，可以不加溶菌酶），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与层析介质的结合。
3.将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNaseA和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
4.将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm (15000 ×g)4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.1.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白
1.将细胞培养液转移至离心杯，5,000rpm(3800 ×g)离心10min，收集菌体得上清，如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用Lysis Buffer 4℃下透析才能加入柱子。
2.对于大体积上清，需加硫酸氨沉淀浓缩，蛋白还需用Lysis Buffer 4℃透析后才能加入柱子。
2.2样品纯化
本套装提供1根填装3ml 预装柱（HisPur Ni NTA Column），2瓶100ml的Lysis Buffer 和1瓶100ml的Elution Buffer。不需层析介质填装和缓冲液配制。整个纯化流程大约需要30min（主要取决于样品体积和溶液的粘稠性），操作快捷。使用时参考下面操作说明。
1.将 HisPur Ni NTA Column固定在铁架台上，依次去掉下端塞和上端塞，流干预装柱的保护液。
2.向柱管中加入5ml Lysis Buffer，平衡柱子，流干Lysis Buffer后，再重复2次，共使用15ml Lysis Buffer平衡。
3.将处理好的样品加入柱管，收集流出液，用于SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况，在出现问题时，更方便寻找解决问题的方案。
4.加入柱管加入5ml Lysis Buffer，进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液目的与收集流出液的目的相同，Lysis Buffer流干后，再重复5次，共使用30ml Lysis Buffer洗杂。
5.使用15-30ml的Elution Buffer进行洗脱目的蛋白，分段收集，每5ml收集一管，分别检测，这样既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
6.依次使用5ml Lysis Buffer和5ml去离子水交替平衡层析介质，重复2次，最后再用5ml 20%的乙醇平衡层析介质，重复1次，然后添加5ml 20%的乙醇到柱管中，置于4℃保存，防止层析介质被细菌污染。
图2. 使用HisPur Ni NTA Column纯化蛋白流程示意图
Step 1：柱子平衡；Step 2：上样；Step 3：洗杂；Step 4：洗脱
3. 在位清洗
当层析介质使用过程中反压过高或层析介质上面出现明显污染时，需要进行在位清洗（Cleaning-in-Place, CIP）。
建议按照下面操作去除层析介质上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
通过使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20分钟可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，清洗层析介质2倍柱体积。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1–2小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。
去除离子作用结合的蛋白
1.5M NaCl溶液接触时间为10-15分钟，再使用去离子水清洗10个柱体积。
4. 问题及解决方案
| 问题 |
原因分析 |
推荐解决方案 |
| 柱子流速慢 |
层析介质被堵塞 |
样品中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。 |
| 样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。 |
| 样品太粘稠 |
有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 |
| 洗脱组分中没有目的蛋白 |
蛋白可能是包涵体，没有在上清中 |
可以通过电泳检测分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。 |
| 表达量太低 |
优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系。 |
| 目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了 |
提高Lysis Buffer的pH，或者降低咪唑浓度。 |
| 目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来 |
降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。 |
| 使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白。 |
| 蛋白降解 |
在4°C下进行纯化操作。 |
| 菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。 |
| 洗脱组分不纯（含有多种蛋白） |
洗杂不彻底 |
增加Lysis Buffer体积。 |
| 样品中含有其他的组氨酸标签蛋白 |
通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。 |
| 层析介质呈现褐色 |
缓冲液中含有DTT等还原剂 |
参考表2，适当降低还原剂DTT的浓度，或者改用巯基乙醇。 |
| 上样过程中蛋白发生沉淀 |
操作温度太低 |
室温下进行上样。 |
| 蛋白发生聚集 |
在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。 |
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