产品介绍
Anti-Flag Tag免疫磁珠在大小为200nm纳米的羧基修饰的磁珠上共价结合了小鼠Anti-Flag Tag单克隆抗体，与传统的Anti-Flag Tag琼脂糖凝胶比较，抗体结合能力相同，背景更低，可用于FLAG Tag融合蛋白的纯化、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)，由于采用磁性分离，使得每次实验可以节省一定的时间。
产品特性
| 项目 |
特性 |
| 抗体纯化方法 |
Protein A 纯化制备 |
| 适用范围 |
Flag-Tag蛋白纯化， IP， Co-IP |
| 推荐使用体积 |
500μL 细胞裂解液样品使用10-20μL磁珠 |
| 融合蛋白结合容量 |
大于0.6 mg protein/mL 磁珠 |
| 储存条件 |
4℃，避光，切勿冻存产品 |
| 缓冲液 |
pH 7.4, 1*PBS（10mM sodium phosphate, 150mM sodium chloride）, and 0.01% (v/v) Proclin 300 |
产品使用说明
1.样品的准备
依据样品选择合适的细胞裂解液，制备好裂解液样品放于冰上或者4度保存。
注：后续实验步骤以500μL裂解液样品为例进行实验步骤说明。
2.磁珠的准备
2.1将Anti-Flag Tag免疫磁珠在小瓶中重新重悬（倾斜并旋转2分钟或用移液器轻轻吹打10次）。
2.2将10-20μL磁珠转入1.5 mL管中（转移量可根据需要调整）。
2.3加入500μL TBST缓冲液，轻轻移液吹打混合。将管子放入磁性支架中，分离磁珠，静置10秒，取出并丢弃上清液。重复此步骤3次。
3.样品的免疫结合（Binding）
从磁性支架中取出试管，将步骤1准备好的500μL裂解液样品加入预洗的磁珠中，并在室温下孵育2小时或在4度下混合过夜。
4洗涤（Washing）
4.1用磁性支架分离磁珠10秒，取出未结合的上清样品（可以保留上清液，用于实验效果分析）。
4.2将500μL TBS缓冲液加入管中并轻轻混合，用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠，再磁性支架收集磁珠并丢弃上清液。重复洗涤3次。
注：可以通过检测上述丢弃上清液的OD280来判断是否洗涤完全，OD280应小于0.05，否则应适当增加洗涤次数。
5.洗脱（Elution）
可以依据实验情况，选择以下三种洗脱方案之一进行洗脱。如果希望洗脱的融合蛋白最大程度保持原有生物活性，可优先使用多肽竞争洗脱方案。
-
1.多肽竞争洗脱（本方法为非变性洗脱方案，洗脱效率高）
1）用TBS制备0.2mg/mL的Flag多肽洗脱液（多肽浓度可以适当调整）。
2）每10-20μL原始磁珠体积，加入100 uL 0.2mg/ml的Flag多肽洗脱液，轻轻涡旋混合并将样品在4°C下在旋转器上孵育2h-4h。
3）在磁性支架上分离磁珠10秒，保存上清液到新的离心管中。上清即为洗脱的融合蛋白。
4）为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复2-3次洗脱步骤。
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2.化学基本洗脱方案（本方法为变性洗脱方案，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测）
1）每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL的1x SDS-PAGE上样缓冲液。
2）在95度水浴上煮5分钟。
3）在磁性支架上分离磁珠10秒，保存上清液到新的离心管中。上清即为洗脱的融合蛋白。
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3.化学酸性洗脱方案（本方法为非变性洗脱方案）
1）每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL的酸性洗脱液（0.1M甘氨酸，pH 3.5），将样品在室温下在旋转器上混合并孵育5-10分钟。
2）在磁性支架上分离磁珠10秒，保存上清液到新的离心管中，并立即加入中和缓冲液（如每100μL的酸性洗脱液加入20μL中和缓冲液（1 M Tris pH 8.5））。上清即为洗脱的融合蛋白。
3）由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.5之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整。
缓冲液汇总
细胞裂解液：正常RIPA 细胞裂解缓冲液
Binding buffer：可以用RIPA代替
Washing buffer：PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)
Elution buffer：直接加入1*蛋白loading buffer, 98℃ 5 min后弃去磁珠后，收集上清液检测
0.05 M TBS ( pH7.4 ) 的配制：Tris (三羟甲基胺基甲烷 )6.05g，NaCl 8.75g，加蒸馏水800ml，磁力棒搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏水至1000ml。
0.05 M TBST ( pH7.4 ) 的配制：Tris (三羟甲基胺基甲烷 )6.05g，NaCl 8.75g，加蒸馏水800ml，加5ml tween20，磁力棒搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏水至1000ml。
常见问题及对策
| 常见问题 |
原因 |
解决方法 |
| 高的背景条带 |
蛋白非特异结合到抗体，磁珠或EP管上洗涤次数不够 |
对裂解液进行预处理去除非特异蛋白； 在最后一次洗涤前, 转移整个样品到新的EP管中然后进行离心。 |
| 洗涤次数不够 |
增加洗涤的时间和次数。 |
| 无蛋白条带 |
Flag标签蛋白没有表达 |
确保目的蛋白带有Flag标签； 制备新鲜的裂解液； 使用恰当的蛋白酶抑制剂。 |
| 孵育时间不足 |
增加孵育时间。 |
| 样品中存在干扰物质 |
裂解液中存在高浓度的DTT，2-mercaptoethanol或者其他的还原剂，更换裂解液。 |
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