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常见问题
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Q1:
beads占介质的10%还是50%
客户购买5ml的填料,我们发的是10ml的,一半的填料,一半的缓冲液
Q2:
用SDS复溶是否兼容?
SDS会影响蛋白和beads结合,尽量避免用离子型和兼型去污剂,可以用非离子型去污剂。
Q3:
蛋白沉淀后复溶是否可行?孵育之后和wash步骤1000g离心5min去上清.30:1或者40:1的比例是否是溶液体积和介质体积比?
(1)蛋白用硫酸铵沉淀后复溶是可以的,不过操作比较繁琐。 (2)孵育之后wash和elution都可以在离心管中操作,离心转速1000g,离心时间1-2min。3.30:1和40:1是细胞裂解液(需纯化样品)和beads(不包含保护液)体积的比例。
Q4:
从哺乳动物细胞里用Strep tag II纯化蛋白,10ug蛋白是用介质孵育还是装成柱子。蛋白用293T胞内表达,纯化5-10盘10cm dish如何使用
真核细胞一般会有游离的生物素,这个可能会影响蛋白和标签的结合,建议在裂解后进行透析或者脱盐换液处理。一般这种样品量比较少的情况建议是孵育操作,样品和beads按照30:1或者40:1这样的比例进行混合孵育。
Q5:
用SDS复溶是否兼容?
SDS会影响蛋白和beads结合,尽量避免用离子型和兼型
Q6:
蛋白沉淀后复溶是否可行?
(1)蛋白用硫酸铵沉淀后复溶是可以的,不过操作比较繁琐。
(2)孵育之后wash和elution都可以在离心管中操作,离心转速1000g,离心时间1-2min。30:1和40:1是细胞裂解液(需纯化样品)和beads(不包含保护液)体积的比例。
Q7:
从哺乳动物细胞里用Strep tag II纯化蛋白
真核细胞一般会有游离的生物素,这个可能会影响蛋白和标签的结合,建议在裂解后进行透析或者脱盐换液处理。一般这种样品量比较少的情况建议是孵育操作,样品和beads按照30:1或者40:1这样的比例进行混合孵育。
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