为构建腺相关病毒（AAV）质粒，Sox4基因的编码区（CDS）被克隆至pAAV-mini-Ucp1-GFP载体中（该载体由厦门大学林圣彩教授提供）。然后将重组质粒与包装质粒AAV2/9和ΔT-6一起使用转染试剂（Biodragon，货号：KX0110055）共转染HEK293T细胞。转染72小时后，收集细胞和含有包装病毒的培养基。通过三轮冻融裂解细胞以释放病毒颗粒。将上清液和含有病毒的培养基一起收集，并使用5倍聚乙二醇（PEG）沉淀。随后，将沉淀物通过碘克沙醇密度梯度超速离心进行纯化。使用特异性引物的qPCR来确定AAV的拷贝数

对于体内实验，携带SOX4构建体的AAV以0.4×10^12拷贝/只的剂量经尾静脉注射至6周龄雄性小鼠，等量的空载体AAV注射至同窝对照组小鼠。经过5周后，小鼠被安乐死，并检查AAV介导的基因调控效果。

在棕色脂肪中过表达SOX4有效缓解了高脂饮食诱导的肥胖。厦门大学生命科学学院李博安团队进一步研究了在棕色脂肪组织（BAT）中过表达SOX4是否能够抵消高脂饮食（HFD）引起的肥胖。注射了AAV-GFP或AAV-SOX4的小鼠分别喂养普通饮食（NCD）或高脂饮食（HFD）（图1A）。在普通饮食条件下，两组小鼠的体重增加相似（图1B）。经过5周的高脂饮食喂养，AAV-SOX4小鼠的体重明显低于AAV-GFP小鼠（图1B）。经过10周的高脂饮食处理后，AAV-SOX4小鼠表现出更好的血糖耐受性和胰岛素敏感性，体脂含量也显著减少（图1C–E）。与AAV-GFP小鼠相比，AAV-SOX4小鼠的BAT、iWAT、gWAT和肝脏占比显著降低（图1F）。此外，AAV-SOX4小鼠的血清甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平也有所下降（图1G, H）。与对照组相比，AAV-SOX4小鼠的脂肪垫和肝脏体积更小（图S5I）。H&E染色显示，AAV-SOX4小鼠的BAT、iWAT、gWAT和肝脏中的脂滴明显更小（图1J, K）。代谢笼分析结果表明，AAV-SOX4小鼠的氧气消耗和产热量增加，而食物摄入量和运动活动则与AAV-GFP小鼠相似（图1L–O）。总体而言，这些结果表明，SOX4在棕色脂肪组织中的过表达能够增加能量消耗，并减轻高脂饮食引起的肥胖。 

图1. 在棕色脂肪中过表达SOX4有效缓解了高脂饮食诱导的肥胖
使用腺相关病毒（AAV）系统，带有Ucp1微型启动子和增强子的AAV载体，用于将GFP（AAV-GFP）或SOX4（AAV-SOX4）通过尾静脉注射到6周龄雄性小鼠体内。随后，小鼠分别接受普通饮食（NCD）或高脂饮食（HFD）。A是示意图，展示了AAV-GFP和AAV-SOX4小鼠在高脂饮食条件下的实验流程，并标明了实验在特定时间进行。B表示在普通饮食或高脂饮食下AAV-SOX4小鼠及对照组的体重增加情况（n=5）。C、D显示了HFD处理11周后小鼠的葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）（n=5）。E显示了第12周时AAV-GFP和AAV-SOX4小鼠的脂肪质量和瘦体质量测定结果（n=5）。F-K展示了实验结束时，在第13周对小鼠进行安乐死，并收集血液和指定组织。各种脂肪垫和肝脏的质量相对于小鼠体重进行了归一化（F）（n=5）。测量了血清中的甘油三酯（TG）（G）和游离脂肪酸（FFA）（H）的水平（n=5）。I展示了代表性外观，J为H&E染色图，K展示了来自脂肪组织的脂肪细胞尺寸分布图。比例尺为75 μm。L-O展示了第12周时，接受高脂饮食的AAV-GFP和AAV-SOX4小鼠在代谢笼中的分析。连续2天内测量了小鼠的食物摄入量（L）、运动活动（M）、氧气消耗（N）和产热量（O）（n=5）。星号（*）表示统计显著性水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计分析通过双尾非配对Student’s t检验（B-G, K，下图；L-O）和双尾非配对Mann-Whitney检验（H；K，上图和中图）进行。