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北京博奥龙:慢病毒包装流程及注意事项​‍
时间:2019-06-14    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


常见的病毒分为慢病毒和腺病毒,慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷丨型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点,因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。

 

慢病毒包装

 

 

慢病毒是一种逆转录病毒,能使外源基因整合入宿主的基因组稳定、长期表达,比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。携带外源基因的慢病毒载体与包装载体(产生病毒颗粒所需的辅助蛋白)一同转染包装细胞,即可进行病毒的包装;包装好的慢病毒为假型病毒(毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒,慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代),然后分泌到细胞外的培养基中,经过离心取得上清液,再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。

   

 

一、慢病毒包装实验流程

 

1、慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,采用PCR技术(采用高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中(cDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。

 

2、 慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体。

 

3、miRNA载体构建从 Genomic 中调取基因相应的Mir 前体, 并在调取引物中引入酶切位点。

 

4、慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒(两质粒包装系统),三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

 

 

二、慢病毒包装注意事项

 

 

1、操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

 

2、操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用 70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

 

3、在慢病毒感染细胞前,为检测病毒上清培养液内病毒的活性,并确定病毒与转染细胞之间的比率,需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞,然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株,进行计数和数值统计。

 

4、在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合,只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞,因此,病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步。

 

5、如需要离心,应使用密封性好的离心管,如有必要请用封口膜封口后离心。

 

6、病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌处理。

 

 

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